ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。該技術自70年代初問世后迅速應用于生物學和醫學科學的許多領域。

ELISA的原理，這一塊相信小伙伴們都是非常熟悉的了，是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔（當然就是我們熟知的96孔板啦）中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。

直接法是利用包被抗原，檢測抗體或者進行重組蛋白的活性驗證，利用蛋白與板材（即微孔板底）通過疏水鍵、流水/離子鍵的被動吸附,通過引入其它活性基團如氨基和碳基的共價結合，以及通過表面改性后的親水鍵結合等等，當然也有利用親和素預包被的板材，通過親和素與生物素的共價結合及親和素有四個殘基理論可結合個生物素的特性，使結合的蛋白更多，靈敏度進一步提高，目前只是該方法的成本會升高。

直接法相對來說靈敏度和特異性較其他方法低，目前使用較少，通常用于重組蛋白或重組抗體的結合活性驗證。而使用親和素包被的板材主要原因在于大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，當然好的板材也是成功的一半，聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能。各方面表現較為均衡，是ELISA 反應中比較常用的固相載體。小分子蛋白由于吸附性較差，固使用這樣間接包被的形式才能起到理想的固定形式。

間接法相對直接法，靈敏度進一步提升，利用一抗與抗原的特異結合，再加入通用二抗（即檢測抗體），如一抗使用的抗某蛋白的鼠抗，二抗可使用鼠/兔等抗該類型抗體（IgG）的抗體，利用抗體的特異性識別，加之顯色用的二抗非直接與抗原結合，所以稱之為間接檢測，該方法一般用于抗體的檢測，如重組抗體，或疫苗效價的檢測，咱們打疫苗的目的就是產生中和抗體嘛，該方法在IVD企業使用較多。

夾心法使用的是兩個抗體夾抗原或者兩個抗原夾抗體的方法，這種復合物被稱之為三明治夾心結構，利用一對配對的抗體，可以特異性檢測抗原，當然主要針對的是具有至少2個以上抗原表位的抗原，畢竟有兩個抗體來結合嘛，抗體的配對可是門技術活，很多公司可以生產抗體，但是配對卻很少做，主要原因在于篩選的難度，可能開發的幾十株針對同一抗原的抗體，都很難有一對合適的可以配對，原因是多方面的，有抗原的表位、構象等原因，也有抗體效價的原因，當然還有篩選成本的原因，所以每一個ELISA試劑盒都是經過多次和長期的驗證得來的哦！且用且珍惜！

那么雙抗原夾抗體也就好理解了，是兩個抗原共同結合一個抗體，也是用于抗體的檢測啦！

競爭法的使用相對來說就窄一點了，其原理是利用抗原抗體結合的可逆性（晶格學說），但在合適濃度時又可達到結合和解離的穩定期，那么親和力更強的抗體自然就能更有效的結合抗原了。一般結合的解離使用最多的就是SPR和BLI技術了，可以高精度或高通量的測抗原/抗體、受體/配體的親和力。

利用已知的抗原進行標記（抗原A），作為對照，實驗組加入樣本（抗原B）及標記抗原，與對照組相比，顯色低，則該抗原A與抗原B競爭結合抗體，這種方法一般用于抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原。

包被抗體進行競爭法呢，一般用于ADA，競爭、非競爭抗抗體鑒定/篩選，抗抗體的競爭篩選是免疫原性檢測手段之一。

說了這么多，原理小伙伴們應該都非常清楚了，那么如何去做呢？Absin為大家整理了詳細的清單！強烈建議收藏！

樣本問題

細胞培養上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20°C冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因為細胞培養用的BSA會影響實驗結果，稀釋后影響減少）。

血清：使用血清分離管收集樣本，樣品室溫放置 30分鐘。離心 15分鐘，轉速為1000 g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因為血清會影響實驗結果，稀釋后影響減少）。

血漿：使用 EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心 15 分鐘，轉速為1000 g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因為血清會影響實驗結果，稀釋后影響減少）。

使用前所有試劑和樣本需放置于室溫，靜置 15分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測。

洗滌液：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象；放置室溫，輕搖混勻，待結晶溶解后再配制洗滌液。依據所需用量計算濃縮洗滌液使用量，可將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的洗滌液。未用完的放4°C。

顯色劑：按當次試驗所需要用量將顯色劑A 和顯色劑B 等體積混合，避光；在使用前15 分鐘準備，現配現用；每孔需100 μL。

稀釋用緩沖液：依據所需用量計算濃縮稀釋劑使用量，可將濃縮稀釋劑用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的稀釋劑。

SA-HRP：如提供的為濃縮 SA-HRP ，則需使用稀釋用緩沖液（1×）稀釋配置成工作濃度的1×SA-HRP,每孔需100 μL。檢測抗體：將干粉離心至管底，檢測抗體的重溶體積請參考瓶身標簽，用稀釋用緩沖液重懸至相應體積。（未用完的檢測抗體溶液可保存于4°C冰箱。）

標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液重溶，重溶體積請參考瓶身標簽，按說明書制備標曲所用的稀釋方式配置。

加樣：加一定稀釋的待檢樣品100 μL于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(按照說明書進行稀釋)100 μL。37℃孵育0.5～1小時，洗滌3次。

加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μL，37℃10～30分鐘。

※  加入終止液后30 分鐘內，使用酶標儀測量450nm 的吸光度值，設定540nm 或 570nm 作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；

※  計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD 值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD 值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。

1）正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2）實驗材料的保存比較重要，一般需要注意的點如下：

※  ELISA試劑盒一般是4℃保存，如果有溶解后的標準品次日需要使用，則需要-20℃，防止降解導致結果不準；

※  未使用的標準品與未用完的試劑盒一起保存，一般試劑盒拆分后建議一周內使用，由于濕度等影響，長期放置易引起產品的不穩定；

※  對于洗滌，常規建議機洗，有些較為老款的洗板機由于時間較久，可能加液沖力較大或有固定的洗滌液，可能會導致結果異常，需慎重選擇；

※  ELISA試劑盒正式實驗前，建議*行預實驗，避免出現濃度超出檢測限導致的結果無法使用的情況；

※  各家試劑盒可能略有差異，使用前建議詳細閱讀說明書。

另：以上試劑盒均提供2000元包檢測服務！

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