活性氧（ROS）是細胞代謝的副產物，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等。它們在細胞信號傳導中起作用，但過量產生會導致細胞損傷，并與多種疾病有關。目前針對ROS的檢測方法包括熒光染色法、化學發光法、電子順磁共振技術（EPR/ESR）、電化學生物傳感器、色譜法、分光光度法和基于熒光蛋白的方法（表1）。

表1 常用ROS的檢測方法

檢測ROS水平對于理解細胞生理功能和環境因素導致的細胞損傷至關重要。今天小愛帶大家重點了解熒光染色法檢測細胞內ROS的原理及具體操作步驟。

活性氧檢測攻略

一、選擇合適的探針

DCFH-DA：這是一種常用的熒光探針，通過檢測其氧化產物DCF的熒光強度來定量細胞內ROS水平。DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細胞膜，在細胞內被酯酶水解生成DCFH，隨后被氧化生成DCF，其熒光強度與ROS水平成正比。

圖1 DCFH-DA探針在細胞內的作用機制^[1]

二、 實驗步驟（以abs580232，活性氧ROS檢測試劑盒為例）

1、裝載ROS探針

1）原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

① 細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞數量小于5×10⁵/mL。

② 藥物誘導：去除細胞培養液，加入無血清培養基稀釋的藥物處理，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定。

③（可選）陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，37℃避光孵育30min-4h，以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa細胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。

④ ROS探針準備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

⑤ ROS探針裝載：吸除處理藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1mL，對于96孔板通常不少于100μL。37℃細胞培養箱內避光孵育30min。

⑥ 細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

2）收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

① 細胞準備：按照標準方法培養細胞，必須保證檢測用細胞狀態。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

② 藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定。

③（可選）陽性對照：先用無血清培養基稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，37℃避光孵育30min-4h以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa細胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。

④ ROS探針準備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

⑤ 探針裝載：除去細胞內藥物，離心收集細胞，加入稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×10⁶-2.0×10⁷。注意：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。例如：對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于10⁴，也不可多于10⁶。

⑥ 細胞清洗：用無血清細胞培養液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

2、熒光顯微鏡檢測

1）對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞，取25-50μL 細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

2）熒光顯微鏡下，選用FITC濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3、流式細胞儀分析

1）對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用0.5-1mL PBS重懸細胞(0.5-1×10⁵/mL)。

2）選擇流式細胞儀FL1或BL1通道，488nm激發，測定530nm的發射，細胞應可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的綠色熒光。

DCFH-DA在ROS檢測中的應用

Gao^[2]等采用標準熒光探針 2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸（abs42197174，DCFH-DA）來測定脂質體處理后4T1細胞內的ROS。具體操作流程如下：

1）將4T1細胞接種在35mm培養皿中，密度為8×10⁴細胞/孔。

2）細胞培養24h匯合度達到70–80%后，將脂質體（1mL，1mg/mL）加入培養基中。配方處理6h后，用PBS洗滌細胞三次。

3）用DCFH-DA（abs42197174，10μM）染色，孵育30min后，用PBS洗滌細胞三次，然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行CLSM成像。

圖2 4T1細胞中的ROS成像^[2]

無論脂質體類型如何，巖藻糖工程化脂質體在4T1細胞中產生的ROS都比非靶向脂質體多（圖2），主要是因為細胞攝取增強。由于DAPC過氧化，DAPC-Fuc在ROS生成方面比DOPC-Fuc更有效。

參考文獻：

[1] Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio Protoc. 2017;7(17):e2545.

[2] Gao Z, Zhang J, Hou Y, et al. Boosting the synergism between cancer ferroptosis and immunotherapy via targeted stimuli-responsive liposomes[J]. Biomaterials.2024;305:122442.

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