一、實驗前準備

1、動物：6–8周性周期規律的SD大鼠（體重180–220g）。

2、主要試劑

• DMEM/F12基礎培養基（abs9560）

• 胎牛血清（abs972）

• ITS （abs9462）

• 雙抗（abs9244）

• 組織解離液（abs9482）

• 0.25%胰蛋白酶-EDTA（abs47014938）

• 10xPBS（abs961）

• 1xPBS（abs962）

• Percoll（abs9102）

• 70um細胞篩網（abs7232）

• 細胞培養皿（35mm）（abs7004）

• 細胞培養皿（60mm）（abs7005）

• 1mL注射針頭

• 抗體：CYP17A1（兔多抗，標記TC）和FSHR（兔多抗，排除顆粒細胞）

二、卵泡膜細胞提取與分選

1、卵巢取材

頸椎脫臼處死 → 75%乙醇消毒 → 迅速摘取雙側卵巢 → 置于冰DMEM/F12（+1%雙抗）中。

2、卵泡預處理

（1）用顯微鑷撕去卵巢被膜及黃體 → 將卵巢置于35mm皿中，加入1mL DMEM/F12。

（2）用1mL注射針頭反復穿刺卵泡，釋放并棄去顆粒細胞-卵母細胞復合體，保留卵泡殘余壁（富含膜細胞）。

3、酶消化

（1）將卵泡殘余壁剪碎成0.5-1mm³ 的小組織塊，將組織塊（100-200mg）轉移到2mL圓底管中，加入1mL消化液（abs9482），37℃水平搖床80rpm的速度輕輕搖動孵育30-40min（根據組織糜爛狀態適當延長時間）

（2）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋管10-20s，通過70um細胞篩網（abs7232）過濾，用10mL PBS沖洗細胞篩網;

（3）收集含有細胞的濾液到50mL管中，20℃下400g離心5min，棄上清。

4、Percoll密度梯度純化

（1）35% Percoll溶液

Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10x)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。

用100% Percoll母液和1xPBS按體積比7:13混合，配制35%等滲Percoll溶液。

（2）50% Percoll溶液

Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10x)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液用100% Percoll母液和1xPBS按體積比1:1混合，配制50%等滲Percoll溶液

（3）吸取1mL 50% percoll深入到15mL離心管底部

（4）用2mL，35% percoll （abs9102）重懸細胞沉淀，沿著管壁緩慢加入含1mL 50% percoll離心管中，覆蓋在50%Percol 溶液的頂部形成密度梯度

▲ 注意：不要破壞35% Percoll和50% Percoll與細胞的懸液的分界面，35%和50% percoll現配現用

（5）400xg，20℃，離心10 min，升速(ACC)1，降速(DEC)1

（6）離心結束后，吸取中間35%/50%界面層細胞（富含TC）至新的15mL離心管中，加入3倍體積4℃預冷1xPBS，上下顛倒混勻， 4℃下400g離心5min，棄上清

（7）按照步驟 （6） 重復清洗一次，棄上清得到細胞

5、差速貼壁進一步去雜

（1）將細胞重懸于 DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 雙抗，接種于 6cm 皿，37℃、5% CO? 孵育 2h。

（2）輕輕吸去未貼壁的顆粒細胞，換新鮮培養基繼續培養。

6、純度鑒定

（1）取培養 24h 的細胞做免疫熒光：CYP17A1?/FSHR? 判定為 TC，純度通常 > 90%。

（2）亦可做 qPCR 檢測 Lhcgr、Cyp17a1 高表達，而 Fshr 低表達。

三、培養與傳代

1、培養基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ITS + 1% 雙抗。

2、每 2–3 天換液；細胞長至 80% 匯合時，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1–2 min，1:3 傳代。

3、前 3 代以內功能很穩定，建議實驗在此窗口內完成。

四、注意事項

1、消化時間勿超 90min，以免降低活率。

2、Percoll離心后收細胞時，界面層需精準吸取，避免混入紅細胞或顆粒細胞。

3、若需無血清實驗，可把 FBS 降至 2% 并添加 ITS（胰島素-轉鐵蛋白-硒）。

今天講解就到這了，大家如有細胞培養問題，歡迎一起交流哦！

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