在創傷性腦損傷（TBI）的研究中，病理過程會隨著時間推移發生顯著變化。不同階段的核心病理事件差異明顯，這就使得多重免疫熒光染色（mIHC）指標的選擇尤為關鍵。今天，我們就來聊聊 TBI 急性期和后兩個月，mIHC 熒光多染分別推薦哪些指標。

一、TBI 急性期（損傷后數小時至 7 天）：關注 “損傷啟動與早期應答"
 

急性期的核心病理包括神經元急性壞死 / 凋亡、血腦屏障（BBB）破壞、神經膠質細胞快速激活、早期炎癥風暴啟動。所以，mIHC 指標要重點覆蓋細胞存活與損傷、膠質激活、炎癥啟動、BBB 破壞這四大維度。
 

推薦核心指標及意義
  

? 神經元損傷與存活：NeuN（神經元核抗原）能特異性標記成熟神經元，可用來量化神經元丟失或存活狀態，因為急性期神經元壞死 / 凋亡會導致 NeuN 表達減少。而 Cleaved caspase-3（活化的半胱天冬酶 - 3）是凋亡細胞的標記，能反映急性期細胞凋亡程度，與 NeuN 共染還可明確神經元凋亡比例。
? 神經膠質細胞激活：GFAP（膠質纖維酸性蛋白）是星形膠質細胞的特異性標志物，急性期星形膠質細胞會快速激活，表現為肥大、增生，GFAP 表達也會顯著上調，能反映膠質應激應答。Iba1（離子化鈣結合適配分子 1）則是小膠質細胞 / 巨噬細胞的特異性標志物，急性期小膠質細胞會迅速從靜息態轉化為激活態（阿米巴樣），通過 Iba1 可標記其數量及形態變化，以此反映炎癥啟動情況。
? 炎癥啟動：TNF-α（腫瘤壞死因子 -α）或 IL-1β（白介素 - 1β）是早期促炎因子，由激活的小膠質細胞 / 星形膠質細胞分泌，是炎癥風暴的核心驅動因子，與 Iba1/GFAP 共染能明確炎癥來源。
? 血腦屏障破壞：Claudin-5（閉合蛋白 - 5）或 ZO-1（緊密連接蛋白 - 1）是 BBB 緊密連接的核心成分，急性期 BBB 破壞會使其表達減少或分布紊亂，結合血管標記物（如 CD31）可評估 BBB 完整性。

 
推薦組合（4-6 色）
   

? 基礎組合：NeuN（神經元）+ GFAP（星形膠質細胞）+ Iba1（小膠質細胞）+ Cleaved caspase-3（凋亡）
? 擴展組合（含 BBB / 炎癥）：NeuN + GFAP + Iba1 + Claudin-5 + TNF-α

 
二、TBI 后 2 個月（慢性期）：聚焦 “修復與長期病理"

損傷后 2 個月進入慢性階段，核心病理有慢性神經炎癥、膠質瘢痕形成、神經再生嘗試、軸突 / 突觸重塑障礙。此時，mIHC 指標要重點覆蓋慢性膠質激活、神經再生、結構重塑、炎癥表型轉換四大維度。

推薦核心指標及意義
  

1、神經元再生與存活：NeuN 仍需用于監測成熟神經元的長期存活狀態，因為慢性期神經元丟失可能持續。DCX（雙皮質素）能特異性標記新生神經元（未成熟神經元），可反映內源性神經發生能力，畢竟 TBI 后室管膜下區可能啟動神經再生。
2、慢性膠質激活與瘢痕形成：GFAP在慢性期，星形膠質細胞會持續激活并參與膠質瘢痕形成，且形態更致密，結合其分布可評估瘢痕范圍。Vimentin（波形蛋白）與 GFAP 共表達于慢性激活的星形膠質細胞，能強化膠質瘢痕的標記，因為瘢痕區星形膠質細胞 Vimentin 表達上調。
3、小膠質細胞炎癥表型轉換：Iba1仍可標記小膠質細胞，但要結合表型標志物區分功能狀態。CD16/32 是促炎表型（M1 型）標志物，能反映慢性促炎狀態，這種狀態可能加劇神經損傷；CD206 是抗炎 / 修復表型（M2 型）標志物，可反映神經保護傾向，有利于組織修復。
4、軸突與突觸重塑：NF-H（神經絲重鏈）或 β-III tubulin 可標記軸突，用于評估慢性期軸突再生或斷裂后的變性（如 Wallerian 變性）。PSD-95（突觸后致密物 - 95）或 Synaptophysin（突觸小泡蛋白）分別標記突觸后膜和突觸小泡，能反映突觸數量及功能狀態，要知道慢性期突觸重塑障礙是神經功能恢復不良的關鍵。
5、血管新生（可選）：CD31（血小板內皮細胞黏附分子）可標記血管內皮細胞，用于評估慢性期腦內血管新生，這與神經修復的血供支持相關。

  
推薦組合（4-6 色）
 

? 基礎組合：NeuN（成熟神經元）+ DCX（新生神經元）+ GFAP（星形膠質細胞）+ Iba1 + CD206（抗炎小膠質細胞）
? 擴展組合（含突觸重塑）：NeuN + DCX + GFAP + Iba1 + PSD-95 + NF-H

三、選擇注意事項

1、抗體兼容性：mIHC 無需避免抗體種屬沖突，比如一抗可以是相同種屬都是兔抗的，建議優先選擇單克隆一抗。
2、熒光素匹配：要避免熒光光譜重疊，如果要做8-10色，可通過光譜拆分技術優化信號。
3、研究側重調整：如果關注 “氧化應激"，急性期可加染 4-HNE（4 - 羥基壬烯醛）；若關注 “鐵沉積"，慢性期可加染 Ferritin（鐵蛋白）。

  
通過針對性地選擇指標，能清晰揭示 TBI 不同階段的病理特征，為機制研究（如炎癥調控、神經再生）或干預靶點（如調控小膠質細胞表型、促進突觸重塑）提供可視化證據。希望這些內容能對從事 TBI 研究的你有所幫助！

   
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