小鼠結(jié)腸炎類器官誘導(dǎo)分為兩步：結(jié)腸類器官的構(gòu)建及結(jié)腸炎類器官的誘導(dǎo)。

結(jié)腸類器官的構(gòu)建

一、準(zhǔn)備工作

1、儀器設(shè)備

CO₂ 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋（abs72023）或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。

2、試劑耗材

小鼠正常結(jié)腸類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9985）、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495）、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）、 100μm濾篩（abs7009）、15ml離心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7035）、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷。

二、操作流程

1、樣本準(zhǔn)備

（1）將組織放入含有預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液 E的取樣瓶中（浸沒整個(gè)組織），4℃從醫(yī)院/實(shí)驗(yàn)室取回。

（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

2、清洗-剪碎

（1）在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）里用2-3ml原代培養(yǎng)緩沖液 B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

3、消化-過濾

（2）向15ml離心管中加入5倍原代組織消化液 C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難，使用5mL消化液通常足夠）在4℃進(jìn)行消化15-30min（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。

（3）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5-50個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。

（4）使用100μm濾篩（abs7009）進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15ml離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清。 

4、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完

低溫金屬冰盒（abs7289）

（2）接種要求

24孔板（abs7035），每孔25ul基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠（abs9495），進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。
 

鋪板密度

結(jié)腸炎類器官的誘導(dǎo)

一、準(zhǔn)備工作

小鼠正常結(jié)腸類器官培養(yǎng)基（abs9984）、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495）、DSS（abs9192）、Mouse IL-6 ELISA Kit（abs520004-96T）、Mouse TNF-α ELISA Kit(Advanced)（abs520032-96T）、 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）、100μm濾篩（abs7009）、15ml離心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7035）、金屬冰盒（abs7289）。

二、結(jié)腸炎類器官誘導(dǎo)方法

傳代后的類器官，在day2-3，類器官雛形出現(xiàn)（囊泡出現(xiàn)），用含有20μg/mL DSS的類器官培養(yǎng)基連續(xù)處理120h，期間每2天換一次DSS的類器官培養(yǎng)基。


三、結(jié)腸炎類器官驗(yàn)證

1、明場(chǎng)驗(yàn)證

每天記錄Control（非炎癥誘導(dǎo)組）和Modle（炎癥誘導(dǎo)組）的類器官明場(chǎng)照片和視頻。

Control

Modle

視頻顯示：與Control相比，Modle類器官形態(tài)結(jié)構(gòu)松散，膨大。

明場(chǎng)圖顯示：與Control相比，Modle類器官壁明顯增厚。

2、HE染色

H＆E顯示：與Control相比，Model類器官壁增厚，上皮排布紊亂，且存在一定程度增生和胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)。

3、類器官活死染

活死染顯示：與Control相比，Model類器官活性有所減弱。

4、FITC葡聚糖熒光染色

FITC葡聚糖熒光染色：與Control相比，Model類器官通透性增強(qiáng)。

5、IL-6和TNF-α檢測(cè)

總結(jié)：通過對(duì)Control（非炎癥誘導(dǎo)組）和Modle（炎癥誘導(dǎo)組）的指標(biāo)對(duì)比，從明場(chǎng)驗(yàn)證、HE染色、類器官活死染、FITC葡聚糖熒光染色、IL-6和TNF-α檢測(cè)等指標(biāo)檢測(cè)，可以驗(yàn)證Modle炎癥誘導(dǎo)成功。

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎一起交流哦！

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