全流程所需試劑及耗材

一、復蘇要點

1、hESC/iPSC完quan培養基配制

1. 4°C下解凍A過夜，勿在37℃培養箱/水浴鍋解凍。A凍融總次數不能超過2次，按5mL每管分裝。

2. 4°C下解凍C過夜，勿在37℃培養箱/水浴鍋解凍。C凍融總次數不能超過2次，按100ul每管分裝。Y27632只在復蘇、傳代的di一天使用，凍存使用。

3. 參考表1，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC完quan培養基，4°C儲存，2周內用完。完quan培養基可分裝-20 °C 下儲存長達 6 個月。

4. 使用前，完quan培養基在室溫下預熱至不再感覺冰涼。

2、基質膠鋪板（以包被6孔板為例）

abs9496-1.5mL×4

1. 將基質膠于4°C冰箱里的冰浴中過夜解凍。200ul、1mL槍頭提前-20℃過夜預冷。

2. 用4°C預冷的DMEM/F12將基質膠原液以1:100的比例進行稀釋。例如：將1.5mL基質膠加入已含有150mLDMEM/F12的離心管中，包被量為300uL/cm2，6孔板每孔10cm2，每孔3mL，均勻鋪開并完quan覆蓋培養板。剩余包被液4℃兩周內用完。

3. 將細胞培養板放置于培養箱預熱。

4. 將含有包被液的培養板在室溫靜置一小時。注意一定不要讓包被過的培養板表面變干。

5. 吸掉包被液，并在培養板上立即種上干細胞與培養基混合液。

3、復蘇 hESC/iPSC（以 6 孔板為例）

1. 將水浴鍋預熱至37℃；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫（15~30℃）。

2. 取3 mL hESC/iPSC完quan培養基，加入6μL Supplement C終濃度為10uM，取9 mL含有Supplement C DMEM/F12，加入18 μL Supplement C使終濃度為10uM，恢復至室溫（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴鍋中預溫培養基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內解凍，肉眼觀察細胞懸液內冰晶即將完quan消失時取出（冰晶剩綠豆大小時）。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL 含Y27的DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。

5. 吸棄六孔板內的鋪板液，將2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完quan培養基靠壁緩慢加入六孔板孔中。

6. 離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細胞混勻在上清中，逐滴緩慢加入 1mL 含有 Supplement C 的 hESC/iPSC 完quan培養基，輕彈管底 3-4 下 混勻細胞，將這 1mL 細胞懸空滴加進 6 孔板的含有 Supplement C 的 hESC/iPSC完quan培養基中。

7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO?濃度，飽和濕度的培養箱中，再次水平十字搖勻三次培養。注：水平十字搖勻3次，左右兩次+上下兩次算一次

8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC完quan培養基，之后每天更換培養基（6孔板，2mL/孔）。注：在hiPSC培養過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養基時，培養基的體積增加至3-4mL/孔。

二、傳代要點

1、條件和比例

圖1. hESC/iPSC完quan培養基連續培養hiPSC細胞形態圖：（A）和（B）分別為hiPSC細胞培養第2和4天時低倍鏡hiPSC培養形態圖示，（C）和（D）為培養至第2和4天時的高倍鏡hiPSC培養形態圖。

（1）傳代條件：

• 細胞匯合度達85%左右（如圖1(C-D)所示），一般情況下每3-4天傳代；

• 細胞匯合度較高，集落變得過于密集或過大；

• 細胞集落分化增多。

（2）傳代比例：

可根據細胞生長狀態和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代。

• 如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻（如圖1(B-D)所示），建議按照1:10進行傳代；

• 如果密度偏低，則可降低傳代比例；

• 密度偏高，則增加傳代比例。

2、消化

圖2：消化hiPSC細胞不同時間形態圖：（A）消化5 min高倍鏡hiPSC培養的的形態圖;（B）消化6 min高倍鏡hiPSC培養的形態圖。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫（~25℃）。

4. 根據傳代接種的孔數準備2 mL/孔+1mL的hESC/iPSC完quan培養基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度為10uM，恢復至室溫（~25℃）。

5. 將孔內培養基吸棄，加入1 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸棄。

6. 加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完quan覆蓋孔底。

7. 置于37℃培養箱中孵育5-6 min。

   注：① 消化5-6 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；hiPSC細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution（＜10min）。② 保持6孔板與培養箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

8. 消化結束后輕輕地將細胞培養板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

9. 及時吸取2 mL/孔預溫的hESC/iPSC完quan培養基+ Supplement C，快速輕柔吹打，利用槍頭中的培養基吹打一次后，吸懸液再吹打一次，使細胞脫離基質。

   注：① 加hESC/iPSC完quan培養基 + Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復吹打；有部分細胞（10%～15%）未脫離基質是正常現象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。② hiPSC細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細胞時操作必須快速，以及zuihao一次操作不要超過4孔（六孔板）。

10. 吸棄6孔板中的Matrigel溶液，加入預溫的hESC/iPSC完quan培養基+ Supplement C 2 mL/孔。

11. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預先設定的傳代比例均勻分配于孔板中。

12. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO?濃度，飽和濕度的培養箱中，再次水平十字搖勻6孔板三次，培養過夜。

13. 18-24小時后更換新hESC/iPSC完quan培養基，此后每天換液，4-5天后繼續傳代/凍存。

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