葡萄膜炎是一類涉及眼球內部多種結構的炎性疾病，具有高發病率與高致盲風險。由于臨床研究存在技術限制和倫理約束，建立可靠的動物模型成為揭示其病理機制和開發治療方法的關鍵途徑。

目前常用的動物模型包括實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）和內毒素誘導的葡萄膜炎兩類。鑒于人類葡萄膜炎多與自身免疫反應相關，EAU模型憑借其高度模擬人類自身免疫病理的特征，成為該領域研究的核心模型體系。

EAU是研究自身免疫性葡萄膜炎的“金標準"動物模型。該模型能準確再現人類疾病的關鍵病理特征，包括淋巴細胞浸潤、血-視網膜屏障破壞及視網膜組織損傷，為疾病機制研究、藥物篩選和治療評估提供了不ke或缺的研究平臺。

一、模型原理與機制

EAU是通過免疫介導的特異性T細胞反應誘發的自身免疫性疾病模型，其核心機制為：

抗原致敏 → T細胞活化 → 血眼屏障突破 → 視網膜攻擊 → 炎癥級聯反應

病理特征模擬：

• 視網膜血管炎、脈絡膜炎

• 光感受器細胞破壞

• 視力功能喪失

• 可模擬急性、慢性及復發性病程

二、抗原的選擇

EAU模型的建立主要依賴于視網膜特異性抗原的免疫誘導。目前常用的誘導抗原包括視網膜可溶性抗原（S-Ag）、光感受器間維生素A類結合蛋白（IRBP）、視紫紅質及恢復蛋白等。

盡管該模型可在小鼠、大鼠、兔、豚鼠及靈長類動物中成功建立，但使用C57BL/6J小鼠所構建的模型與人類自身免疫性葡萄膜炎的臨床病理特征最為接近，因而成為該領域研究中最ju代表性的動物模型。

通過方法學的持續優化，目前已被廣泛采用的經典建模方案為：以IRBP抗原片段IRBP_651-670與wan全弗氏佐劑（CFA）乳化后，聯合百日咳毒素（PTX）對C57BL/6J小鼠進行免疫，可穩定誘導出具有典型病理特征的EAU模型。

三、標準化造模方案

適用動物品系

試劑組分清單

本方案選取zui常用的C57BL/6J小鼠造模，詳細造模流程如下：

1、實驗動物：通常選擇6-8周齡C57BL/6J小鼠，20-25g。
2、動物適應：將動物在SPF實驗環境中適應1周，保持溫度、濕度和光照條件穩定，自由飲食。
3、EAU模型建立
（1）PTX 溶液配制：將50μg 百日咳毒素（PTX，abs42024900）粉末溶于 500μL PBS（abs962）中，配制成1μg/μL 濃度的 PTX 溶液。

警告： PTX具有多種生物學效應。避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。穿戴適當的實驗室服裝，包括實驗服、手套和護目鏡。處理凍干粉時應在生物安全柜中進行，建議佩戴丁腈手套，避免產生粉塵和氣溶膠。使用前，應輕柔搖晃，不要進行劇烈漩渦振蕩，使懸液混合均勻。實驗后殘留PTX溶液及接觸物品應按照生物危險品規范處理，避免環境污染。

（2）IRBP_651-670溶液配制：取 25mg IRBP_651-670多肽（abs45156497）粉末，加入1mL的100% DMSO（abs9185），充分溶解，得到25mg/mL DMSO多肽儲存液。將 4mL 的無菌PBS（abs962）緩慢加入到儲存液中，混合均勻，最終得到5 mL的 5 mg/mL IRBP_651-670多肽PBS工作溶液，將溶液在-80℃冰箱和 37℃水浴鍋中反復凍融 2-4 次，直至液體澄清且無顆粒。   

（3）抗原乳液制備：按照 1:1 體積比將IRBP_651-670多肽溶液和 FCA 溶液（abs90351）加入兩支5 mL玻璃注射器中，并通過三通連接兩支注射器（需提前將器具滅菌處理，防止雜菌污染破壞毒素和抗原活性），在冰上反復推注40 min-2h，將抗原乳化至油包水狀態，IRBP_651-670多肽濃度達到 2.5 mg/mL。

警告：熱滅活的結核分枝桿菌刺激先天免疫反應，避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。制備佐劑時嚴格避免針刺傷，因為它可能導致肉芽腫或誘發自身免疫反應。

乳化質量嚴格驗證

①直觀與離心雙重檢測:合格的乳化液呈均勻白色粘稠狀，將其滴入水面后應不擴散，這是判斷油包水狀態的直觀標準，也可將乳化液轉入離心管，以3000r/min離心1分鐘，若無明顯分層則說明乳化wan全。

②微觀粒徑輔助判斷:顯微鏡下觀察乳化液，需保證油包水結構的粒徑<5μm 的占比超90%，粒徑過大或分布不均會導致抗原釋放不均，進而造成動物個體間模型癥狀差異大，影響實驗重復性。

（4）麻醉小鼠：使用1.25%三溴乙醇溶液（abs90556）按照 0.2 mL/kg 的劑量對小鼠進行腹腔注射麻醉。

（5）EAU造模：首先對麻醉后小鼠剃毛，在小鼠頸背部、兩側腹肋部和尾根部（避免刺入肌肉層）四點各注射50 μL 乳液（確保注射均勻，避免局部積液），共200μL（總量500 μg）。皮下注射IRBP乳化液后，立即進行腹腔注射 1 次PTX，每只小鼠 1μg（10μL）。

（6）對照組處理：對照組小鼠在相同部位皮下注射等體積的10% DMSO PBS溶液，不注射IRBP乳化液和百日咳毒素。

4、動物分組及處理

免疫前將小鼠隨機分為空白對照組、模型組和治療組，免疫后第14天（第14天是組織學驗證的最佳時間點，臨床評分可更早開始）取小鼠的眼球（和脾臟），進行后續功能試驗。實驗流程圖如下：

圖1 實驗流程圖

四、模型評價與驗證體系

1、臨床評分（輔助標準：基于裂隙燈觀察，評分≥1 分即可判定成功）

從造模后第 8 天起，每隔一天使用裂隙燈觀察小鼠的眼前段，眼底照相機觀察小鼠的眼底。眼前段和眼底的評分標準如表1。

評分：0 個“+"得 0 分；1-3 個“+"得 1 分；4-6 個“+"得 2 分；7-9 個“+"得 3 分；10-12 個“+"得 4 分；13-15 個“+"得 5 分。

表1 EAU小鼠眼前段臨床評分標準^[1-2]

圖2 裂隙燈眼前段代表性圖。a：造模后 0 d，結膜無充血，角膜透明，房水清。b：造模后 14 d，可見混合充血（++），房水閃輝，角膜仍透明。c：造模后 21 d，混合充血（+），角膜透明，房水清，炎癥明顯減輕。藍色箭頭示混合充血，黑色箭頭示房水細胞^[3] 。

圖3 眼底照相機代表性圖。a：造模后0 d，眼底玻璃體清，視盤清晰，視網膜平伏，血管正常無炎癥。

2、組織病理學評分（金標準：基于HE染色，評分≥1 分即可判定成功）

取材時間點：在免疫后第14天，將小鼠處死，取出眼球。

固定方法：對眼球進行固定、脫水、包埋、切片(4–6 μm，每只眼至少 3 張切片)，并進行HE染色（abs9217）。

評分標準：依據 Caspis 標準，0–4 分，對病理切片進行評分

病理表現：視網膜折疊、炎癥細胞浸潤、血管炎等。

表2  EAU小鼠視網膜組織學評分^[1-2]

圖4 造模后0 d，視網膜結構清晰，內界膜完整。b：造模后14 d，玻璃體滲出，視網膜腫脹、皺褶，可見肉芽腫及血管炎癥，內界膜脫離。c：造模后21 d，視網膜結構紊亂，皺褶明顯，伴血管炎癥。紅色箭頭示玻璃體滲出，黑色箭頭示視網膜皺褶，黃色箭頭示血管炎，綠色箭頭示肉芽腫^[3]。

3、免疫學驗證（輔助/機制驗證）

T細胞亞群分析（流式細胞術）：Th17細胞比例顯著升高（關鍵指標）、Treg細胞比例一般無顯著變化

細胞因子檢測（qPCR + ELISA）：Il17a mRNA、IL-17A（abs552721）、TNF-α（abs520032） 蛋白表達上調等

蛋白質組學/信號通路驗證（如STING（abs173857）/NF-κB（abs159078）/IL-6（abs148146）通路激活）

4、血-視網膜屏障功能評估（可選）

伊文思藍滲漏實驗：尾靜脈注射伊文思藍（abs47002009），觀察視網膜血管滲漏情況。

緊密連接蛋白表達（Western Blot）：OCCLUDIN（abs154942）、CLAUDIN-5（abs146481）表達下降提示屏障破壞。

圖 5 棕櫚酸處理、對照溶劑處理 EAU 小鼠以及未免疫小鼠注射伊文思藍后的視網膜鋪片^[1]

5、影像學與功能學驗證（可選，用于深入分析）

光學相干斷層掃描：評估視網膜厚度和結構層次。

眼底熒光血管造影：評估血管滲漏和屏障破壞。

視網膜電圖：評估光感受器功能損傷（建議在免疫后第21-28天進行）。

6、綜合判定標準

金標準：組織病理學評分 ≥1分，且模型組顯著高于對照組。

輔助標準：臨床評分 ≥1分 + 免疫學驗證（如Th17比例升高）。

可選標準：血-視網膜屏障破壞、影像學異常、功能學損傷等。

實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型以其高仿生性與可重復性，已成為眼科自身免疫性疾病研究的基石。它不僅是一個科研工具，更是連接基礎機制與臨床治療的關鍵橋梁。通過我們提供的標準化建模方案、系統評價體系與配套試劑產品，研究人員可高效構建穩定、可靠的EAU模型，深入探究疾病機制，加速藥物篩選與治療策略開發。

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參考文獻：

[1] 馮曉潔.棕櫚酸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的作用及機制研究[D].重慶醫科大學,2024.
[2] Tian L, Yang P, Lei B, et al. AAV2-mediated subretinal gene transfer of hIFN-α attenuates experimental autoimmune uveoretinitis in mice. PLoS One. 2011;6(5):e19542. doi:10.1371/journal.pone.0019542
[3] 李金清,張秋瑾,鄭柳,等.PKM2/STAT3在實驗性自身免疫性葡萄膜炎小鼠中的表達和作用[J].眼科新進展, 2025, 45(12):938-942.

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