每個稀釋管中加入 250 μL 稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋， 每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最gao點(10000pg/mL)，稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0 pg/mL）。
三、實驗操作步驟
1、準備好所有需要的試劑和標準品；
2、從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3、向微孔板中加入300µL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4、分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔 100µL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育 2  小時;
5、將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液 300µL， 然后將板內洗滌液吸去。重復操作 3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最hou一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6、在每個微孔內加入 100µL 檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育 2 小時；
7、重復第 5步洗板操作；
8、在每個微孔內加入 100µL SA-HRP，室溫孵育 20 分鐘。注意避光；
9、重復第 5  步洗板操作；
10、在每個微孔內加入 100 µL 顯色液，室溫孵育 5-30 分鐘，注意避光；
11、在每個微孔內加入 50 μL 終止液，孔內溶液顏色會從藍色變為黃色。如果溶液顏色變為綠色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12、加入終止液后 30 分鐘內，使用酶標儀測量 450nm 的吸光度值，設定 540nm 或570nm 作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13、計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品 OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應 OD 值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最jia擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
四、試劑盒參數
1、回收率
在細胞培養基樣本中摻入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，測定其回收率?；厥章史秶?2 -93%，平均回收率在87%。
在人血清樣本中摻入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，測定其回收率。回收率范圍在114.2-119.4%，平均回收率在 117.0%。
2、靈敏度
人PD-L1/B7-H1 的最di可測劑量（MDD）一般小于 11.5pg/mL。
最di可測值是根據 20 個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3、校正
此 ELISA 試劑盒經 NS0 表達的高純度重組人PD-L1/B7-H1蛋白所校正。
4、線性
樣本為經10μg/mL PHA刺激5天的人PBMC細胞；經測定，刺激后人PBMC上清液中PD-L1平均濃度為3600pg/mL。

5、特異性
此 ELISA 法可檢測天然及重組人PD-L1/B7-H1蛋白。 將以下因子用稀釋劑（1×） 配制成 100 ng/mL 的濃度來檢測與人PD-L1/B7-H1的交叉反應。 將 100 ng/mL 的干擾因子摻入中間范圍的重組人PD-L1/B7-H1對照品中，來檢測對人PD-L1/B7-H1 的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。重組人 PD-1/Fc Chimera  沒有交叉反應，但當濃度> 50 ng / mL 時有干擾。

五、常見問題解析